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La aplicación de sustancias naturales con acción bactericida es el objetivo de las investigaciones dirigidas a una producción más sostenible, lo que implica en diversas fuentes de sustancias para nuevas formulaciones terapéuticas. Este estudio presenta la caracterización química, la toxicidad y la actividad antimicrobiana del aceite esencial (AE) de las hojas de Bixa orellana Labill. El AE fue extraído por hidrodestilación a 100º C durante 3h. Se determinaron los parámetros fisicoquímicos y la caracterización química se realizó mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC/MS). El ensayo de toxicidad se realizó mediante el bioensayo con Artemia salina Leach. Para evaluar la actividad antimicrobiana se utilizaron los métodos de Difusión en Disco y Dilución en Caldo frente a las bacterias Escherichia coli y Staphylococcus aureus. La CL50 en el ensayo de toxicidad se verificó en 355 mg L-1 y fue clasificada como no tóxica. El EO presentó actividad antimicrobiana contra los microorganismos ensayados y totalizó 320 mg EAT g-1 de fenoles totales. Los resultados obtenidos destacan la importancia de señalar este producto como alternativa terapéutica, fomentando su potencial de aplicación.