La TLC si basa sul principio classico della cromatografia, secondo il quale i componenti di una miscela vengono separati tra una fase stazionaria fissa e una fase mobile liquida grazie all'affinità differenziale tra le due fasi. Composti diversi viaggiano a velocità diverse a causa della diversa attrazione per la fase stazionaria e della diversa solubilità nel solvente. Laseparazione dei composti si basa sulla competizione tra il soluto e la fase mobile per i posti di legame sulla fase stazionaria.