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Diplomarbeit aus dem Jahr 1996 im Fachbereich Chemie - Biochemie, Note: 1,3, Ludwig-Maximilians-Universität München (Unbekannt), Sprache: Deutsch, Abstract: Inhaltsangabe:Zusammenfassung:
Die vorliegende Arbeit befaßt sich mit dem Antigenpeptid-Transporter TAP, dem eine Schlüsselrolle in der Immunerkennung infizierter oder entarteter Zellen zukommt. So werden Proteinbruchstücke, die mit Hilfe des Proteasomenkomplexes im Zytosol erzeugt werden von TAP in das endoplasmatische Retikulum gepumpt, wo sie mit MHC-Klasse-I Molekülen assemblieren. Nachdem Transport dieses Komplexes auf die Zelloberfläche tasten zytotoxische T-Lymphocyten die präsentierten Peptide ab und eliminieren Zellen, die Fragmente von zellfremden Proteinen tragen.
Im ersten Teil dieser Studie werden neue, nicht-radioaktive Möglichkeiten zur Untersuchung der Peptid-TAP-Wechselwirkung entwickelt. So werden elektronenmikroskopische Analysen mit Goldkörnchen-tragenden Peptiden besprochen und die Nutzung des S-Peptids der Ribonuklease-S oder Luciferin-markierter Peptide diskutiert. Besonders wird auf das Potential von Peptiden eingegangen, die mit Fluoreszenzsonden gekoppelt wurden. So zeigte sich, daß Fluorescein-markierte Peptide sowohl für die Quantifizierung der Peptidbindung und des Peptidtransports als auch zur Untersuchung der räumlichen Struktur der Peptidbindungstasche hervorragend geeignet sind.
Im zweiten Teil wird das Herpes-Simplex-Virus Protein ICP47 charakterisiert, das durch die Inhibierung von TAP die Immunerkennung des Virus und somit die Lyse der infizierten Zelle verhindert. Die Wechselwirkung dieses klinisch hoch-relevanten Immunmodulators mit seinem Zielprotein TAP wird ausführlich kinetisch und thermodynamisch analysiert. Dabei wird auf die Speziesspezifität verschiedener Herpes-Simplex-Virus Stämme eingegangen. Darüber hinaus werden strukturelle Besonderheiten, die durch eine Membran-ICP47-Wechselwirkung erzeugt werden, theoretisch und CD-spektroskopisch untersucht. Schließlich wird mit Hilfe von Sequenz-vergleichenden Studien und durch Experimente mit systematisch verkürzten ICP47-Varianten die aktive Domäne des viralen Inhibitors lokalisiert.
Neben den wissenschaftlichen Ergebnissen sind zahlreiche für die Biochemie essentielle Techniken beschrieben. So wird das Bakulovirus-Expressionssystem mit den dafür notwendigen Methoden der Insektenzellkultur, Bakulovirusamplifikation und -infektion erläutert. Außerdem werden Mikrosomenisolationsverfahren, Gelektrophorese, reversed phase Chromatographie und Assays zur Bestimmung der Proteinkonzentration verwendet. Zusätzlich werden Methoden zur Proteinmarkierung, wie die Einführung des radioaktiven Isotops 125I oder die kovalente Kopplung mit Fluoreszenzsonden oder Goldkörnchen gezeigt. Zur Untersuchung der Peptid-TAP-Wechselwirkung werden Filtrations- und Zentrifugationsexperimente durchgeführt.
Inhaltsverzeichnis:Inhaltsverzeichnis:
A.Einleitung1
1.Antigenpräsentation über MHC-Klasse-I-Moleküle1
2.Die Familie der ABC-Transporter3
3.Störung der Immunerkennung als Pathogenizitätsprinzip6
4.Motivation und Zielsetzung8
B.Material und Methoden9
1.Material9
1.1Zellen, Baculoviren und Medien9
1.2Enzyme und Standards9
1.3Chemikalien und Verbrauchsmaterial9
1.4Puffertabelle11
1.5Geräte12
2.Zellkultur 13
2.1Passage und Expansion von Insektenzellen13
2.2Anlegen eines Baculovirusstocks14
2.3Baculovirusinfektion und Ernte infizierter Insektenzellen14
2.4Mikrosomenpräparation15
3.Synthesen und Reinigungsverfahren15
3.1Luziferin-markierte Peptide16
3.2 Gold-markierte Peptide18
3.3Fluorescein-markierte Peptide20
3.4Reinigung von ICP47(1-53)22
3.5Iodierung von TAP-Liganden23
3.5.1Isolation von radioaktiv-markierten Peptiden23
3.5.2Isolation von radioaktiv-markiertem ICP47(1-53)23
...
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Die vorliegende Arbeit befaßt sich mit dem Antigenpeptid-Transporter TAP, dem eine Schlüsselrolle in der Immunerkennung infizierter oder entarteter Zellen zukommt. So werden Proteinbruchstücke, die mit Hilfe des Proteasomenkomplexes im Zytosol erzeugt werden von TAP in das endoplasmatische Retikulum gepumpt, wo sie mit MHC-Klasse-I Molekülen assemblieren. Nachdem Transport dieses Komplexes auf die Zelloberfläche tasten zytotoxische T-Lymphocyten die präsentierten Peptide ab und eliminieren Zellen, die Fragmente von zellfremden Proteinen tragen.
Im ersten Teil dieser Studie werden neue, nicht-radioaktive Möglichkeiten zur Untersuchung der Peptid-TAP-Wechselwirkung entwickelt. So werden elektronenmikroskopische Analysen mit Goldkörnchen-tragenden Peptiden besprochen und die Nutzung des S-Peptids der Ribonuklease-S oder Luciferin-markierter Peptide diskutiert. Besonders wird auf das Potential von Peptiden eingegangen, die mit Fluoreszenzsonden gekoppelt wurden. So zeigte sich, daß Fluorescein-markierte Peptide sowohl für die Quantifizierung der Peptidbindung und des Peptidtransports als auch zur Untersuchung der räumlichen Struktur der Peptidbindungstasche hervorragend geeignet sind.
Im zweiten Teil wird das Herpes-Simplex-Virus Protein ICP47 charakterisiert, das durch die Inhibierung von TAP die Immunerkennung des Virus und somit die Lyse der infizierten Zelle verhindert. Die Wechselwirkung dieses klinisch hoch-relevanten Immunmodulators mit seinem Zielprotein TAP wird ausführlich kinetisch und thermodynamisch analysiert. Dabei wird auf die Speziesspezifität verschiedener Herpes-Simplex-Virus Stämme eingegangen. Darüber hinaus werden strukturelle Besonderheiten, die durch eine Membran-ICP47-Wechselwirkung erzeugt werden, theoretisch und CD-spektroskopisch untersucht. Schließlich wird mit Hilfe von Sequenz-vergleichenden Studien und durch Experimente mit systematisch verkürzten ICP47-Varianten die aktive Domäne des viralen Inhibitors lokalisiert.
Neben den wissenschaftlichen Ergebnissen sind zahlreiche für die Biochemie essentielle Techniken beschrieben. So wird das Bakulovirus-Expressionssystem mit den dafür notwendigen Methoden der Insektenzellkultur, Bakulovirusamplifikation und -infektion erläutert. Außerdem werden Mikrosomenisolationsverfahren, Gelektrophorese, reversed phase Chromatographie und Assays zur Bestimmung der Proteinkonzentration verwendet. Zusätzlich werden Methoden zur Proteinmarkierung, wie die Einführung des radioaktiven Isotops 125I oder die kovalente Kopplung mit Fluoreszenzsonden oder Goldkörnchen gezeigt. Zur Untersuchung der Peptid-TAP-Wechselwirkung werden Filtrations- und Zentrifugationsexperimente durchgeführt.
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A.Einleitung1
1.Antigenpräsentation über MHC-Klasse-I-Moleküle1
2.Die Familie der ABC-Transporter3
3.Störung der Immunerkennung als Pathogenizitätsprinzip6
4.Motivation und Zielsetzung8
B.Material und Methoden9
1.Material9
1.1Zellen, Baculoviren und Medien9
1.2Enzyme und Standards9
1.3Chemikalien und Verbrauchsmaterial9
1.4Puffertabelle11
1.5Geräte12
2.Zellkultur 13
2.1Passage und Expansion von Insektenzellen13
2.2Anlegen eines Baculovirusstocks14
2.3Baculovirusinfektion und Ernte infizierter Insektenzellen14
2.4Mikrosomenpräparation15
3.Synthesen und Reinigungsverfahren15
3.1Luziferin-markierte Peptide16
3.2 Gold-markierte Peptide18
3.3Fluorescein-markierte Peptide20
3.4Reinigung von ICP47(1-53)22
3.5Iodierung von TAP-Liganden23
3.5.1Isolation von radioaktiv-markierten Peptiden23
3.5.2Isolation von radioaktiv-markiertem ICP47(1-53)23
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