A deterioração dos alimentos de origem animal está relacionada com uma vasta gama de reações, destacando-se as de origem microbiológica. Dentre as substâncias antimicrobianas utilizadas para inibir micro-organismos em produtos lácteos industrializados destacam-se: as bacteriocinas, os antibióticos macrolídeos polienos e os ácidos orgânicos. Com o intuito de garantir a segurança alimentar e a conformidade com a legislação, reprimindo fraudes, métodos de detecção rápida e simultânea para a determinação desses compostos estão em alta demanda. Neste trabalho, foram desenvolvidos métodos com simplificada extração, curto tempo de análise cromatográfica (cerca de dez minutos) e aplicados a diversas matrizes lácteas para determinação simultânea de natamicina, ácido sórbico, nisina e tilosina por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS). Todos os parâmetros de validação avaliados ficaram de acordo com os critérios estabelecidos pela Decisão 657/2002/EC. Os métodos foram utilizados para avaliar a conformidade de 135 amostras comerciais, o que demonstra versalidade e aplicabilidade.