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Diplomarbeit aus dem Jahr 1997 im Fachbereich Chemie - Biochemie, Note: 1,0, Westfälische Wilhelms-Universität Münster (Chemie, Biochemie), Sprache: Deutsch, Abstract: Inhaltsangabe:Zusammenfassung:
In der vorliegenden Diplomarbeit wurde die Modulation der Genexpression in porkinen Endothelzellen, humanen Makrophagen und porkinen glatten Muskelzellen durch GM-CSF untersucht. Dazu wurden Zellkulturen angelegt, die über verschiedene Zeiträume und mit unterschiedlichen Konzentrationen an GM-CSF inkubiert wurden. Aus diesen Zellkulturen wurde die Gesamt-RNA isoliert.
Die Gesamt-RNA der glatten Muskelzellen wurde für Differential Display-Versuche verwendet. Nach reversen Transkriptionen konnten mittels Differential-Display-PCR durch Kombination verschiedener Primer mehrere differentiell exprimierte Produkte detektiert werden, von denen ein etwa 500 Basen großes Fragment reamplifiziert und über 236 Basen sequenziert wurde. Nennenswerte Homologien zu bereits bekannten Sequenzen konnten nicht nachgewiesen werden. Die Synthese einer cRNA-Sonde und damit die Bestätigung der differentiellen Expression dieses Fragments steht noch aus.
Die Gesamt-RNA der Endothelzellen und der Makrophagen wurde in Northern-Blot-Analysen untersucht. Mit Hilfe einer Antisense-cRNA-Sonde gegen die a1(VIII)-mRNA des Kollagen-Typ-VIII (transkribiert anhand der humanen pBSIIa1Col8alphacDNA) konnte nach einer Nivellierung der Ergebnisse gegen einen internen Standard (GA3P-DH-mRNA) gezeigt werden, dass GM?CSF die Kollagen-Typ-VIII-mRNA-Expression porkiner, vaskulärer Endothelzellen beeinflußt. In allen Versuchsreihen mit verschiedene Konzentrationen in Abhängigkeit von der Induktionszeit konnte mit Ausnahme der 0,1 pg-Versuchsreihe gezeigt werden, dass GM-CSF nach einer Anlaufphase von bis zu 4 h die Expression von Kollagen-Typ-VIII-mRNA unterschiedlich stark stimuliert. In der Messreihe mit 0,1-pg GMalphaCSF/ml Medium wirkte GM-CSF von Beginn des Versuches an hemmend auf die Expression der Kollagen-Typ-VIII-mRNA. In allen 24 h-Induktionen wirkt GM-CSF hemmend auf die Kollagen-Typ-VIII-mRNA-Expression.
Kollagen-Typ-VIII wird von mit GM-CSF behandelten Makrophagen exprimiert. Daten zum Einfluss von GM-CSF auf Makrophagen in Abhängigkeit von der Konzentration und Inkubationsdauer liegen bislang nicht vor.
Inhaltsverzeichnis:Inhaltsverzeichnis:
InhaltsverzeichnisI
AbkürzungsverzeichnisIV
1.Einleitung1
1.1Der Aufbau der Arterienwand1
1.2Arteriosklerose2
1.2.1Das pathologische Erscheinungsbild der Arteriosklerose2
1.3Untersuchte Zelltypen der arteriosklerotischen Läsion3
1.3.1Endothelzellen3
1.3.2Glatte Muskelzellen4
1.3.3Makrophagen6
1.4Kollagene8
1.4.1Klassifizierung von Kollagenen9
1.4.2Kollagen Typ VIII11
1.5Zytokine, Wachstumsfaktoren und koloniestimulierende Faktoren13
1.5.1Der Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierende Faktor14
2.Aufgabenstellung17
3.Materialien18
3.1Geräte18
3.2Chemikalien und Materialien19
3.3Lösungen, Puffer und Medien24
4.Methoden37
4.1Kultivierung von Säugetierzellen37
4.1.1Verwendete Säugerzellen und ihre Herkunft37
4.1.1.1Porkine Endothelzellen37
4.1.1.2Porkine glatte Muskelzellen38
4.1.1.3Humane Monozyten/Makrophagen38
4.1.2Isolierung und Primärkultur vaskulärer, porkiner Endothelzellen aus Aorten38
4.1.3Kultivierung von porkinen glatten Muskelzellen aus Aorten39
4.1.4Isolierung und Kultivierung humaner Monozyten40
4.1.5Subkultivierung von Monolayer-Zellkulturen41
4.1.6Induktionsversuche mit GM-CSF41
4.2Charakterisierung der verwendeten Zellen43
4.2.1Endothelzellen43
4.2.2Glatte Muskelzellen43
4.3Molekular- und mikrobiologische Arbeitsmethoden48
4.3.1Isolierung der Gesamt-RNA48
4.3.1.1Lyse der Zellen aus der Monolayer-Zellkultur48
4.3.1.2CsCl-Zentri...
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In der vorliegenden Diplomarbeit wurde die Modulation der Genexpression in porkinen Endothelzellen, humanen Makrophagen und porkinen glatten Muskelzellen durch GM-CSF untersucht. Dazu wurden Zellkulturen angelegt, die über verschiedene Zeiträume und mit unterschiedlichen Konzentrationen an GM-CSF inkubiert wurden. Aus diesen Zellkulturen wurde die Gesamt-RNA isoliert.
Die Gesamt-RNA der glatten Muskelzellen wurde für Differential Display-Versuche verwendet. Nach reversen Transkriptionen konnten mittels Differential-Display-PCR durch Kombination verschiedener Primer mehrere differentiell exprimierte Produkte detektiert werden, von denen ein etwa 500 Basen großes Fragment reamplifiziert und über 236 Basen sequenziert wurde. Nennenswerte Homologien zu bereits bekannten Sequenzen konnten nicht nachgewiesen werden. Die Synthese einer cRNA-Sonde und damit die Bestätigung der differentiellen Expression dieses Fragments steht noch aus.
Die Gesamt-RNA der Endothelzellen und der Makrophagen wurde in Northern-Blot-Analysen untersucht. Mit Hilfe einer Antisense-cRNA-Sonde gegen die a1(VIII)-mRNA des Kollagen-Typ-VIII (transkribiert anhand der humanen pBSIIa1Col8alphacDNA) konnte nach einer Nivellierung der Ergebnisse gegen einen internen Standard (GA3P-DH-mRNA) gezeigt werden, dass GM?CSF die Kollagen-Typ-VIII-mRNA-Expression porkiner, vaskulärer Endothelzellen beeinflußt. In allen Versuchsreihen mit verschiedene Konzentrationen in Abhängigkeit von der Induktionszeit konnte mit Ausnahme der 0,1 pg-Versuchsreihe gezeigt werden, dass GM-CSF nach einer Anlaufphase von bis zu 4 h die Expression von Kollagen-Typ-VIII-mRNA unterschiedlich stark stimuliert. In der Messreihe mit 0,1-pg GMalphaCSF/ml Medium wirkte GM-CSF von Beginn des Versuches an hemmend auf die Expression der Kollagen-Typ-VIII-mRNA. In allen 24 h-Induktionen wirkt GM-CSF hemmend auf die Kollagen-Typ-VIII-mRNA-Expression.
Kollagen-Typ-VIII wird von mit GM-CSF behandelten Makrophagen exprimiert. Daten zum Einfluss von GM-CSF auf Makrophagen in Abhängigkeit von der Konzentration und Inkubationsdauer liegen bislang nicht vor.
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1.1Der Aufbau der Arterienwand1
1.2Arteriosklerose2
1.2.1Das pathologische Erscheinungsbild der Arteriosklerose2
1.3Untersuchte Zelltypen der arteriosklerotischen Läsion3
1.3.1Endothelzellen3
1.3.2Glatte Muskelzellen4
1.3.3Makrophagen6
1.4Kollagene8
1.4.1Klassifizierung von Kollagenen9
1.4.2Kollagen Typ VIII11
1.5Zytokine, Wachstumsfaktoren und koloniestimulierende Faktoren13
1.5.1Der Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierende Faktor14
2.Aufgabenstellung17
3.Materialien18
3.1Geräte18
3.2Chemikalien und Materialien19
3.3Lösungen, Puffer und Medien24
4.Methoden37
4.1Kultivierung von Säugetierzellen37
4.1.1Verwendete Säugerzellen und ihre Herkunft37
4.1.1.1Porkine Endothelzellen37
4.1.1.2Porkine glatte Muskelzellen38
4.1.1.3Humane Monozyten/Makrophagen38
4.1.2Isolierung und Primärkultur vaskulärer, porkiner Endothelzellen aus Aorten38
4.1.3Kultivierung von porkinen glatten Muskelzellen aus Aorten39
4.1.4Isolierung und Kultivierung humaner Monozyten40
4.1.5Subkultivierung von Monolayer-Zellkulturen41
4.1.6Induktionsversuche mit GM-CSF41
4.2Charakterisierung der verwendeten Zellen43
4.2.1Endothelzellen43
4.2.2Glatte Muskelzellen43
4.3Molekular- und mikrobiologische Arbeitsmethoden48
4.3.1Isolierung der Gesamt-RNA48
4.3.1.1Lyse der Zellen aus der Monolayer-Zellkultur48
4.3.1.2CsCl-Zentri...
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