Identifizierung und Charakterisierung des HSP70 Makronukleus-Gens aus Euplotes crassus
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Diplomarbeit aus dem Jahr 1998 im Fachbereich Chemie - Biochemie, Note: 1,5, Philipps-Universität Marburg (Unbekannt), Sprache: Deutsch, Abstract: Inhaltsangabe:Zusammenfassung:Bei dem hypotrichen Ciliaten E.crassus wurde das Makronukleus-Chromosom, welches das HSP7O-Gen trägt, identifiziert. Für die Identifikation eines internen Gen-Fragmentes wurde die Methode der heterologen PCR angewendet. Die 5'- und 3'-Enden des Gens konnten mit einem telomerspezifischen Primer und mit homologen Primern, die aus dem internen PCR-Fragment abgeleitet wurden, amplifiziert werden. Nach Sequenzierung der P...
Diplomarbeit aus dem Jahr 1998 im Fachbereich Chemie - Biochemie, Note: 1,5, Philipps-Universität Marburg (Unbekannt), Sprache: Deutsch, Abstract: Inhaltsangabe:Zusammenfassung:
Bei dem hypotrichen Ciliaten E.crassus wurde das Makronukleus-Chromosom, welches das HSP7O-Gen trägt, identifiziert. Für die Identifikation eines internen Gen-Fragmentes wurde die Methode der heterologen PCR angewendet. Die 5'- und 3'-Enden des Gens konnten mit einem telomerspezifischen Primer und mit homologen Primern, die aus dem internen PCR-Fragment abgeleitet wurden, amplifiziert werden. Nach Sequenzierung der PCR-Fragmente und einem Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen mit Aminosäuresequenzen aus weiteren Organismen wurde eine Homologie von bis zu 95 % festgestellt.
Untersuchungen zur Kopienzahl zeigten, daß im Makronukleus das HSP7O-Gen in einer Kopienzahl von 2000-2500 Kopien vorlag. Dies entsprach der durchschnittlichen Kopienzaht von E.crassus.
Um Promotor-Elemente zu identifizieren, wurde der Transkriptionsstartpunkt bestimmt. Eine Analyse der 5'-nicht kodierten Region zeigte, daß keine Sequenzhomologie zu den bekannten core-Promotor-Elementen TATA-Box und Initiator-Element bestand. Durch Sequenzvergleiche mit der bekannten Konsensussequenz der Hitze-Schock-Elemente wurden jedoch zwei Hitze-Schock-Elemente identifiziert.
Weitere Untersuchungen zur Expression des HSP7O-Gens nach Hitzeschock und ohne Hitzeschock erfolgten sowohl auf der Ebene der RNA als auch auf der Protein-Ebene. Durch eine Northern-Blot-Analyse wurde eine erhöhte Transkripmenge der HSP70-mRNA in hitzeinduzierten Ciliaten festgestellt. Auf der Protein-Ebene zeigte sich jedoch kein quantitativer Unterschied zwischen hitzeinduzierten und nicht hitzeinduzierten Zellen.
Inhaltsverzeichnis:Inhaltsverzeichnis:
1.ZUSAMMENFASSUNG1
2.EINLEITUNG2
2.1Die Genomorganisation des hypotrichen Ciliat Euplotes crassus2
2.2Konjugation und Makronukleusentwicklung bei Euplotes crassus4
2.3Transk:riptinelle Regulation der Genexpression5
2.4Transkriptionelle Regulation der Genexpression am Beispiel der Hitzeschockgene7
2.5Ziel der Arbeit8
3.MATERIAL9
3.1Chemikalien9
3.2Radioisotope10
3.3Verbrauchsmaterialien10
3.4Geräte11
3.5Enzyme12
3.6Primer12
3.7Organismen14
3.8Plasmide und Gene14
4.METHODEN15
4.1Kultivierung15
4.1.1Kultivierung von Dunaliella tertiolecta15
4.1.2Kultivierung von Euplotes crassus15
4.1.3Kultivierung von Escherichia coli16
4.2Herstellung RNase-freier Geräte und Lösungen16
4.2.1Geräte und Allgemeines16
4.2.2Lösungen16
4.3Reinigung und Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren17
4.3.1Phenolextraktion17
4.3.2Ethanolfällung17
4.3.3Isopropanolfällung17
4.3.4Butanolfällung18
4.3.5Elution von DNA aus Agarosegelen mit Hilfe des "QIAquick Gel Extraction Kits"18
4.3.6Entfernung von Nukleotide und Salze aus der DNA durch das "QIAquick Nucleotide Removal Kit"18
4.3.7Aufreinigung von PCR-Ansätze mit Hilfe des "QIAquick PCR Purification Kit"19
4.3.8Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren19
4.3.9Elution von DNA aus Agarosegelen durch Einfrieren und Ausquetschen19
4.4Präparation von Nukleinsäuren20
4.4.1Präparation von RNA20
4.4.2Präparation von DNA aus Euplotes crassus20
4.4.3Plasmidisolierung aus Escherichia coli in kleinerem Maßstab21
4.4.4Plasmidisolierung aus Escherichia coli größerem Maßstab21
4.5Amplifikation von DNA-Fragmenten mittels der PCR21
4.6Klonierung von DNA-Fragmenten in Plasmidvektoren23
4.6.1DNA-Spaltung mit Restriktionsendonukleasen23
4.6.2DNA-Ligation23
4.6.3Herstellung eines "T-Vektors"23
4.6.4Klonierung von PCR-Fragmenten24
4.6.5Herstellung elektrokompetenter E. coli Zellen24
4.6.6Elektropo...
Bei dem hypotrichen Ciliaten E.crassus wurde das Makronukleus-Chromosom, welches das HSP7O-Gen trägt, identifiziert. Für die Identifikation eines internen Gen-Fragmentes wurde die Methode der heterologen PCR angewendet. Die 5'- und 3'-Enden des Gens konnten mit einem telomerspezifischen Primer und mit homologen Primern, die aus dem internen PCR-Fragment abgeleitet wurden, amplifiziert werden. Nach Sequenzierung der PCR-Fragmente und einem Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen mit Aminosäuresequenzen aus weiteren Organismen wurde eine Homologie von bis zu 95 % festgestellt.
Untersuchungen zur Kopienzahl zeigten, daß im Makronukleus das HSP7O-Gen in einer Kopienzahl von 2000-2500 Kopien vorlag. Dies entsprach der durchschnittlichen Kopienzaht von E.crassus.
Um Promotor-Elemente zu identifizieren, wurde der Transkriptionsstartpunkt bestimmt. Eine Analyse der 5'-nicht kodierten Region zeigte, daß keine Sequenzhomologie zu den bekannten core-Promotor-Elementen TATA-Box und Initiator-Element bestand. Durch Sequenzvergleiche mit der bekannten Konsensussequenz der Hitze-Schock-Elemente wurden jedoch zwei Hitze-Schock-Elemente identifiziert.
Weitere Untersuchungen zur Expression des HSP7O-Gens nach Hitzeschock und ohne Hitzeschock erfolgten sowohl auf der Ebene der RNA als auch auf der Protein-Ebene. Durch eine Northern-Blot-Analyse wurde eine erhöhte Transkripmenge der HSP70-mRNA in hitzeinduzierten Ciliaten festgestellt. Auf der Protein-Ebene zeigte sich jedoch kein quantitativer Unterschied zwischen hitzeinduzierten und nicht hitzeinduzierten Zellen.
Inhaltsverzeichnis:Inhaltsverzeichnis:
1.ZUSAMMENFASSUNG1
2.EINLEITUNG2
2.1Die Genomorganisation des hypotrichen Ciliat Euplotes crassus2
2.2Konjugation und Makronukleusentwicklung bei Euplotes crassus4
2.3Transk:riptinelle Regulation der Genexpression5
2.4Transkriptionelle Regulation der Genexpression am Beispiel der Hitzeschockgene7
2.5Ziel der Arbeit8
3.MATERIAL9
3.1Chemikalien9
3.2Radioisotope10
3.3Verbrauchsmaterialien10
3.4Geräte11
3.5Enzyme12
3.6Primer12
3.7Organismen14
3.8Plasmide und Gene14
4.METHODEN15
4.1Kultivierung15
4.1.1Kultivierung von Dunaliella tertiolecta15
4.1.2Kultivierung von Euplotes crassus15
4.1.3Kultivierung von Escherichia coli16
4.2Herstellung RNase-freier Geräte und Lösungen16
4.2.1Geräte und Allgemeines16
4.2.2Lösungen16
4.3Reinigung und Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren17
4.3.1Phenolextraktion17
4.3.2Ethanolfällung17
4.3.3Isopropanolfällung17
4.3.4Butanolfällung18
4.3.5Elution von DNA aus Agarosegelen mit Hilfe des "QIAquick Gel Extraction Kits"18
4.3.6Entfernung von Nukleotide und Salze aus der DNA durch das "QIAquick Nucleotide Removal Kit"18
4.3.7Aufreinigung von PCR-Ansätze mit Hilfe des "QIAquick PCR Purification Kit"19
4.3.8Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren19
4.3.9Elution von DNA aus Agarosegelen durch Einfrieren und Ausquetschen19
4.4Präparation von Nukleinsäuren20
4.4.1Präparation von RNA20
4.4.2Präparation von DNA aus Euplotes crassus20
4.4.3Plasmidisolierung aus Escherichia coli in kleinerem Maßstab21
4.4.4Plasmidisolierung aus Escherichia coli größerem Maßstab21
4.5Amplifikation von DNA-Fragmenten mittels der PCR21
4.6Klonierung von DNA-Fragmenten in Plasmidvektoren23
4.6.1DNA-Spaltung mit Restriktionsendonukleasen23
4.6.2DNA-Ligation23
4.6.3Herstellung eines "T-Vektors"23
4.6.4Klonierung von PCR-Fragmenten24
4.6.5Herstellung elektrokompetenter E. coli Zellen24
4.6.6Elektropo...
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