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Diplomarbeit aus dem Jahr 2001 im Fachbereich Biologie - Genetik / Gentechnologie, Note: 1,0, Universität Salzburg (Naturwissenschaften), Sprache: Deutsch, Abstract: Inhaltsangabe:Zusammenfassung:
In dieser Arbeit wird ein Protein behandelt, dessen cDNA aus Xenopus laevis kloniert wurde und den Namen Brix trägt. Diese cDNA codiert für ein potentielles Polypeptid mit 339 Aminosäuren (Genbank Accession: AF319877). In den Genomen von Mensch, C.elegans, Hefe und Arabidopsis thaliana existieren hoch homologe ORFs.
Das Brix Protein lokalisiert im Nukleolus und den Cajal Bodies und interagiert mit 5S, 5,8S und 28S rRNA. In Saccharomyces cerevisiae codiert YOL077c (bzw. BRXl) für das Brix Homolog. YOL077c ist essentiell für das Wachstum der Zellen und lokalisiert ebenfalls im Nucleolus. Eine Expressionsverminderung von Brx1p inhibiert die Synthese der 60S ribosomalen Untereinheit und die Prozessierung der 35S prä- rRNA.
Ziel dieser Arbeit war es, Interaktionspartner von Brix mitHilfe des Yeast Two- Hybrid Systems zu finden. Die Art dieser Interaktionspartner liefert Hinweise auf die zellulären Abläufe, in denen Brix involviert ist.
5 bekannte Proteine konnten als Two- Hybrid- Interaktionspartner identifiziert werden.
Alle Two- Hybrid- Interaktionspartner unterstützen die bisher experimentell gewonnenen Hinweise auf eine direkte Beteiligung von Brix in der Ribosomenbiogenese und weisen auf eine Beteiligung von Brix sowohl in prä- rRNA Reifung und Ribosomenzusammenbau, als auch in Splicing und Modifikationen anderer RNAs hin.
Inhaltsverzeichnis:Inhaltsverzeichnis:
1.Einleitung3
2.Aufgabenstellung15
3.Material17
3.1Bakterienstämme17
3.2Hefestämme17
3.3Vektoren18
3.3.1Two- Hybrid- Vektoren18
3.3.2Matchmaker cDNA- Bank für Two- Hybrid- Screen19
3.3.3Reporterplasmid p8op-lacZ20
3.4Oligonucleotide für PCR und Sequenzierreaktionen21
3.5Chemikalien und Enzyme21
4.MEDIEN22
4.1Hefemedien22
4.1.1Medien generell22
4.1.2Medien für Two-Hybrid-Screen24
4.2Bakterienmedien25
5.METHODEN27
5.1Herstellung chemisch kompetenter E. coli27
5.2DNA- Präparationsmethoden28
5.2.1Plasmidisolierung aus E. coli: (Miniprep)28
5.2.2Plasmidisolierung aus Saccharomyces cerevisiae durch Sphäroplastierung30
5.3Polymerasekettenreaktion (PCR)31
5.4Klonierungsmethoden32
5.4.1Restriktionen32
5.4.2DNA-Gelelektrophorese33
5.4.3Elution von DNA aus Agarosegelstücken33
5.4.4Ligationen34
5.5Transformationsmethoden34
5.5.1Transformation von E. coli34
5.5.2Transformation von Saccharomyces cerevisiae35
5.6DNA- Sequenzierung36
5.7Two- Hybrid- Analyse37
5.7.1LexA- Two- Hybrid Transformation37
5.7.1.1Einfrieren der vermehrten Transformanten41
5.7.2Screening der Library Cotransformanten auf Two- Hybrid Interaktionen42
5.7.3Eliminierung falsch- positiver Klone44
5.7.3.1Screen nach Reporteraktivierung ohne Galaktoseinduktion des Prey44
5.7.3.2Plasmidverlusttest45
5.8Rescue positiver Library- Plasmide via Transformation in E. coli KC845
5.9Retransformation in den Reporterstamm46
5.10Sequenzierung und Charakterisierung der Insertsequenz46
6.ERGEBNISSE UND DISKUSSION47
6.1Klonierung von BRIX47
6.2Überprüfung der Hintergrundaktivierung durch die LexA-Brix-Fusion im Reporterstamm, EGY 48[p8op-LacZ]48
6.3Two-Hybrid-Analyse49
6.3.1Prinzip und Schema der Methode49
6.3.2Screen nach Interaktionen zwischen Bait und Prey56
6.3.3Verifikation der Interaktionen58
6.3.3.1Reporteraktivierung ohne Galaktoseinduktion des Prey58
6.3.3.2Plasmidverlusttest58
6.4Rescue des Library-Plasmids59
6.5Retransformation der Plasmide in den Reporterstamm59
6.6Bestimmung der Interaktionspartner durch Sequenzierung und Daten...
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In dieser Arbeit wird ein Protein behandelt, dessen cDNA aus Xenopus laevis kloniert wurde und den Namen Brix trägt. Diese cDNA codiert für ein potentielles Polypeptid mit 339 Aminosäuren (Genbank Accession: AF319877). In den Genomen von Mensch, C.elegans, Hefe und Arabidopsis thaliana existieren hoch homologe ORFs.
Das Brix Protein lokalisiert im Nukleolus und den Cajal Bodies und interagiert mit 5S, 5,8S und 28S rRNA. In Saccharomyces cerevisiae codiert YOL077c (bzw. BRXl) für das Brix Homolog. YOL077c ist essentiell für das Wachstum der Zellen und lokalisiert ebenfalls im Nucleolus. Eine Expressionsverminderung von Brx1p inhibiert die Synthese der 60S ribosomalen Untereinheit und die Prozessierung der 35S prä- rRNA.
Ziel dieser Arbeit war es, Interaktionspartner von Brix mitHilfe des Yeast Two- Hybrid Systems zu finden. Die Art dieser Interaktionspartner liefert Hinweise auf die zellulären Abläufe, in denen Brix involviert ist.
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3.3.1Two- Hybrid- Vektoren18
3.3.2Matchmaker cDNA- Bank für Two- Hybrid- Screen19
3.3.3Reporterplasmid p8op-lacZ20
3.4Oligonucleotide für PCR und Sequenzierreaktionen21
3.5Chemikalien und Enzyme21
4.MEDIEN22
4.1Hefemedien22
4.1.1Medien generell22
4.1.2Medien für Two-Hybrid-Screen24
4.2Bakterienmedien25
5.METHODEN27
5.1Herstellung chemisch kompetenter E. coli27
5.2DNA- Präparationsmethoden28
5.2.1Plasmidisolierung aus E. coli: (Miniprep)28
5.2.2Plasmidisolierung aus Saccharomyces cerevisiae durch Sphäroplastierung30
5.3Polymerasekettenreaktion (PCR)31
5.4Klonierungsmethoden32
5.4.1Restriktionen32
5.4.2DNA-Gelelektrophorese33
5.4.3Elution von DNA aus Agarosegelstücken33
5.4.4Ligationen34
5.5Transformationsmethoden34
5.5.1Transformation von E. coli34
5.5.2Transformation von Saccharomyces cerevisiae35
5.6DNA- Sequenzierung36
5.7Two- Hybrid- Analyse37
5.7.1LexA- Two- Hybrid Transformation37
5.7.1.1Einfrieren der vermehrten Transformanten41
5.7.2Screening der Library Cotransformanten auf Two- Hybrid Interaktionen42
5.7.3Eliminierung falsch- positiver Klone44
5.7.3.1Screen nach Reporteraktivierung ohne Galaktoseinduktion des Prey44
5.7.3.2Plasmidverlusttest45
5.8Rescue positiver Library- Plasmide via Transformation in E. coli KC845
5.9Retransformation in den Reporterstamm46
5.10Sequenzierung und Charakterisierung der Insertsequenz46
6.ERGEBNISSE UND DISKUSSION47
6.1Klonierung von BRIX47
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6.3Two-Hybrid-Analyse49
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