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Diplomarbeit aus dem Jahr 2002 im Fachbereich Chemie - Biochemie, Note: 1,0, Universität Bielefeld (Fakultät für Chemie), Sprache: Deutsch, Abstract: Inhaltsangabe:Einleitung:
Ein CD30+-Hodgkin-Lymphom ist eine maligne Erkrankung, für die eine Antikörpertherapie sehr vielversprechend ist. Ziel der Arbeit war es, für einen solchen Therapieansatz aus den DNA-Sequenzen herkömmlicher rekombinanter bispezifischer Antikörper-Fragmente ein im Bezug auf Wirksamkeit und Stabilität optimiertes Format herzustellen und zu charakterisieren. Zur Optimierung der Expression sollten zwei bispezifische Diabodies anti-CD16/CD30 bakteriell exprimiert und aufgereinigt werden. Die verbesserten Expressionseigenschaften einer Variante des bsDb gegen CD30 (mCD30) sollte durch den Vergleich mit dem Wildtyp bsDb bestätigt werden.
Aus den scFv gegen CD30 und CD16 sollten anschließend zwei bispezifische und tetravalente Tandemdiabodies mit unterschiedlichen Aminosäure-Linkern generiert werden. Die Konstrukte der TandDb sollten ebenfalls exprimiert und aufgereinigt werden. Die Antikörper-Fragmente mit der Spezifität anti-CD30/CD16 dirigiert NK-Zellen an H-RS-Zellen, initiieren die ADCC der NK-Zellen und führt zu einer spezifischen Lyse der H-RS-Zellen. Ein weiteres Ziel war es, die im Rahmen dieser Arbeit hergestellten rekombinanten Antikörper-Fragmente zu charakterisieren und im Rahmen eines in vitro-Cytotoxizitätstests gegen eine etablierte Hodgkin Zelllinie die therapeutischen Wirksamkeit zu überprüfen. Auf diese Weise sollten neuartige Formen rekombinanter Antikörper-Fragmente generiert und getestet werden, um die Grundlage für eine effektive Antikörper-basierte Therapie für die Hodgkinsche Krankheit zu etablieren.
Inhaltsverzeichnis:Inhaltsverzeichnis:
1.Einleitung1
1.1Die Hodgkinsche Krankheit1
1.2Molekularbiologische Eigenschaften von Hodgkin-und Reed-Sternberg-Zellen3
1.3Das CD30-Antigen5
1.4Cytotoxische Mechanismen von natürlichen Killerzellen7
1.5Struktur und Funktion von Immunglobulinen und bispezifischen Antikörper-Fragmenten (Diabodies/Tandemdiabodies)9
2.Aufgabenstellung14
3.Zusammenfassung15
4.Material16
4.1Laborbedarf16
4.2Geräte16
4.3Chemikalien17
4.4Puffer, Medien und andere Lösungen18
4.5Enzyme21
4.6Antikörper21
4.7Bakterienstämme22
4.8Zelllinien22
4.9Oligonucleotide23
4.10Vektoren24
5.Methoden26
5.1Molekularbiologische Methoden26
5.1.1Polymerase-Kettenreaktion (PCR)26
5.1.2Splice overlap extension-PCR26
5.1.3Restriktionsspaltung von DNA27
5.1.4Agaroseelektrophorese von DNA-Fragmenten27
5.1.5Dephosphorylierung von 5 -Enden der linearisierten Vektoren28
5.1.6Ligation von DNA-Fragmenten28
5.1.7Transformation von kompetenten Bakterien28
5.1.8Isolierung von Plasmid-DNA aus E. Coli29
5.1.9Konservierung der Bakterienklone29
5.2Proteinbiochemische Methoden29
5.2.1Präparation von periplasmatischen Extrakten29
5.2.2Großexpression von Antikörper-Fragmenten in E. Coli30
5.2.3Isolierung von Antikörper-Fragmenten aus dem periplasmatischen Raum30
5.2.4Dialysemembranen31
5.2.5Ammoniumsulfatpräzipitation der Antikörper-Fragmente31
5.2.6Immobilisierte Metall-Chelat-Chomatographie (IMAC)31
5.2.7SDS-PAGE32
5.2.8Westernblot-Analyse32
5.2.9Überprüfung des Klonierungserfolgs33
5.2.10Ionenaustauschchromatographie33
5.2.11Bestimmung der Protein-Konzentration34
5.2.12Bestimmung des Antikörper-Formats35
5.3Zellkultur-Methoden35
5.3.1Kultivierung eukaryontischer Zellen35
5.3.2PBMC-/Granulozyten-Präparation36
5.3.3BsAk-vermittelter in vitro-Cytotoxizitätstest37
5.4Durchflusscytometrie38
5.4.1Bindungstest von periplasmatischen Extrakten und aufgereinigten Antikörper-Fragmenten39
5.4.2Titrati...
Ein CD30+-Hodgkin-Lymphom ist eine maligne Erkrankung, für die eine Antikörpertherapie sehr vielversprechend ist. Ziel der Arbeit war es, für einen solchen Therapieansatz aus den DNA-Sequenzen herkömmlicher rekombinanter bispezifischer Antikörper-Fragmente ein im Bezug auf Wirksamkeit und Stabilität optimiertes Format herzustellen und zu charakterisieren. Zur Optimierung der Expression sollten zwei bispezifische Diabodies anti-CD16/CD30 bakteriell exprimiert und aufgereinigt werden. Die verbesserten Expressionseigenschaften einer Variante des bsDb gegen CD30 (mCD30) sollte durch den Vergleich mit dem Wildtyp bsDb bestätigt werden.
Aus den scFv gegen CD30 und CD16 sollten anschließend zwei bispezifische und tetravalente Tandemdiabodies mit unterschiedlichen Aminosäure-Linkern generiert werden. Die Konstrukte der TandDb sollten ebenfalls exprimiert und aufgereinigt werden. Die Antikörper-Fragmente mit der Spezifität anti-CD30/CD16 dirigiert NK-Zellen an H-RS-Zellen, initiieren die ADCC der NK-Zellen und führt zu einer spezifischen Lyse der H-RS-Zellen. Ein weiteres Ziel war es, die im Rahmen dieser Arbeit hergestellten rekombinanten Antikörper-Fragmente zu charakterisieren und im Rahmen eines in vitro-Cytotoxizitätstests gegen eine etablierte Hodgkin Zelllinie die therapeutischen Wirksamkeit zu überprüfen. Auf diese Weise sollten neuartige Formen rekombinanter Antikörper-Fragmente generiert und getestet werden, um die Grundlage für eine effektive Antikörper-basierte Therapie für die Hodgkinsche Krankheit zu etablieren.
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1.Einleitung1
1.1Die Hodgkinsche Krankheit1
1.2Molekularbiologische Eigenschaften von Hodgkin-und Reed-Sternberg-Zellen3
1.3Das CD30-Antigen5
1.4Cytotoxische Mechanismen von natürlichen Killerzellen7
1.5Struktur und Funktion von Immunglobulinen und bispezifischen Antikörper-Fragmenten (Diabodies/Tandemdiabodies)9
2.Aufgabenstellung14
3.Zusammenfassung15
4.Material16
4.1Laborbedarf16
4.2Geräte16
4.3Chemikalien17
4.4Puffer, Medien und andere Lösungen18
4.5Enzyme21
4.6Antikörper21
4.7Bakterienstämme22
4.8Zelllinien22
4.9Oligonucleotide23
4.10Vektoren24
5.Methoden26
5.1Molekularbiologische Methoden26
5.1.1Polymerase-Kettenreaktion (PCR)26
5.1.2Splice overlap extension-PCR26
5.1.3Restriktionsspaltung von DNA27
5.1.4Agaroseelektrophorese von DNA-Fragmenten27
5.1.5Dephosphorylierung von 5 -Enden der linearisierten Vektoren28
5.1.6Ligation von DNA-Fragmenten28
5.1.7Transformation von kompetenten Bakterien28
5.1.8Isolierung von Plasmid-DNA aus E. Coli29
5.1.9Konservierung der Bakterienklone29
5.2Proteinbiochemische Methoden29
5.2.1Präparation von periplasmatischen Extrakten29
5.2.2Großexpression von Antikörper-Fragmenten in E. Coli30
5.2.3Isolierung von Antikörper-Fragmenten aus dem periplasmatischen Raum30
5.2.4Dialysemembranen31
5.2.5Ammoniumsulfatpräzipitation der Antikörper-Fragmente31
5.2.6Immobilisierte Metall-Chelat-Chomatographie (IMAC)31
5.2.7SDS-PAGE32
5.2.8Westernblot-Analyse32
5.2.9Überprüfung des Klonierungserfolgs33
5.2.10Ionenaustauschchromatographie33
5.2.11Bestimmung der Protein-Konzentration34
5.2.12Bestimmung des Antikörper-Formats35
5.3Zellkultur-Methoden35
5.3.1Kultivierung eukaryontischer Zellen35
5.3.2PBMC-/Granulozyten-Präparation36
5.3.3BsAk-vermittelter in vitro-Cytotoxizitätstest37
5.4Durchflusscytometrie38
5.4.1Bindungstest von periplasmatischen Extrakten und aufgereinigten Antikörper-Fragmenten39
5.4.2Titrati...