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A presente investigação foi concebida com o objectivo de formular filmes de Chitosan (CH) por ligação cruzada com citrato de sódio (Nacit), tripolifosfato de sódio (NaTPP) ou sulfato de condroitina (CS) que devem ser capazes de simular a permeação in vitro do modelo de droga polar, 5-Fluorouracil (5-FU) e droga não polar, Indometacina (INDO) através de rato/coelho ou epiderme humana. O desenho de optimização foi utilizado para identificar e optimizar várias variáveis de processo e formulação significativamente (p<0,05) influenciando a permeação de ambos os fármacos através destes filmes. Além disso, os resultados foram avaliados para o efeito da densidade de ligação cruzada na permeação in vitro utilizando análise espectroscópica de absorção atómica para análise espectroscópica de Na+, DSC e IR. A permeação in vitro tanto do 5-FU como do INDO através de formulações optimizadas de filmes reticulados com CH-NaTPP, CH-Nacit ou CH-CS foi considerada comparável à obtida através de folhas de rato, coelho e epidérmicas humanas. Estes resultados indicam que estas películas CH optimizadas têm um potencial a ser desenvolvido como substitutos das folhas epidérmicas de cadáveres animais e humanos para estudos preliminares de permeação in vitro.