Untersuchung zur Medienoptimierung und zur Kultivierungsmethodik durch Immobilisierung am Baculovirus Expressionssystem
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Diplomarbeit aus dem Jahr 2000 im Fachbereich Medizin - Biomedizinische Technik, Note: 1,3, Technische Universität Berlin (Biomedizinische Technik, Bioverfahrenstechnik), Sprache: Deutsch, Abstract: Inhaltsangabe:Gang der Untersuchung:Diese Arbeit wurde unter der Zielsetzung angefertigt, die Methodik der Immobilisierung für das System SF21/ACMNPV zu optimieren und Maßstabsübertragungen bis hin zu technischen Fermentationen mit vergrößerten Arbeitsvolumina zu realisieren.Ein Teil der Arbeit befasste sich mit dem Bereich der Optimierung des Kultivierungsmediums, wobei von einer Medienformu...
Diplomarbeit aus dem Jahr 2000 im Fachbereich Medizin - Biomedizinische Technik, Note: 1,3, Technische Universität Berlin (Biomedizinische Technik, Bioverfahrenstechnik), Sprache: Deutsch, Abstract: Inhaltsangabe:Gang der Untersuchung:
Diese Arbeit wurde unter der Zielsetzung angefertigt, die Methodik der Immobilisierung für das System SF21/ACMNPV zu optimieren und Maßstabsübertragungen bis hin zu technischen Fermentationen mit vergrößerten Arbeitsvolumina zu realisieren.
Ein Teil der Arbeit befasste sich mit dem Bereich der Optimierung des Kultivierungsmediums, wobei von einer Medienformulierung ausgegangen wurde, die in ihrer handelsüblichen Form schon ohne den Zusatzstoff Serum auskommt, und daher am ehesten zu einer Massenproduktion mit dem BEVS geeignet erscheint. Zu diesem Zweck wurden in der Literatur [1,8,15] gefundene Hinweise auf eventuell limitierende Medieninhaltsstoffe untersucht.
In vergleichenden Untersuchungen wurde versucht, die Zellen- bzw. Virenausbeuten in einen Zusammenhang mit überkonzentriert zugesetzten Medienkomponenten zu bringen.
Desweiteren wurden Hungerexperimente mit verkapselten Insektenzellkulturen vorgenommen, um Informationen über geeignete Fütterungsintervalle in Abhängigkeit der Zelldichte zu bekommen. Diesem Versuch lag die sogenannte Nutritional Depth" - Theorie [31 ], die für Suspensionskulturen aufgestellt wurde, zugrunde. Wie die Ergebnisse zeigen, kann dies für immobilisierte Kulturen nicht bestätigt werden.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine neuartige Technologie zur Immobilisierung von Zellen auf ihre Anwendbarkeit mit dem Natrium-Cellulosesulfat-Poly-DADMAC-System hin untersucht. Es handelte sich hierbei um ein Verkapselungsgerät der Firma Inotech, das im Gegensatz zu anderen vertropfenden Geräten auf dem dynamischen Prinzip resonanzinduzierter Zerlegung eines Strahls beruht, und somit höhere Durchflussraten und kürzere Verkapselungszeiten erwarten ließ.
Nach entsprechenden Modifikationen wurden mit diesem Gerät Kapselmengen erzeugt, die unter Anwendung der bisherigen Methode die 8-10fache Zeit in Anspruch genommen hätten. Die erzeugten Kapseln wurden in einem zu einem Standardrührkessel umfunktionierten Zellkulturfermenter mit 11 Arbeitsvolumen unter kontrollierter Rührerdrehzahl und konstantem Sauerstoffpartialdruck kultiviert.
Bei dieser weit über 1000 h dauernden Fermentation konnte das schon zuvor beobachtete Phänomen erkannt werden, dass immobilisierte Insektenzellen des Stammes SF 21 durch die Infektion mit Baculovirus AcMNPV nicht absterben, sondern noch mehrere hundert Stunden nach der Infektion Aktivität zeigen.
Inhaltsverzeichnis:Inhaltsverzeichnis:
InhaltsverzeichnisI
AbkürzungenII
1.Kurzfassung1
2.Einleitung2
3.Stand des Wissens5
3.1Produktion von Baculoviren als Biopestizide5
3.2Erhöhung der Effizienz der Viren6
3.3Erhöhung der Ausbeute7
3.3.1Medien7
3.3.2Kultivierungsmethoden8
3.4Immobilisierung10
3.4.1Immobilisierung in Cellulosesulfat10
3.4.2Immobilisierung Inotech11
3.5MTT12
3.6TEM13
4.Problemstellung15
5.Material und Methoden17
5.1Material17
5.1.1Zellinie und Virus17
5.1.2Geräte17
5.1.3Reagenzien18
5.2Methoden22
5.2.1Kultivierung der Zellen22
5.2.1.aAuftauen22
5.2.1.bKultivieren23
5.2.1.cKultivierung im Schüttelkolben23
5.2.1.dKapselkulturen24
5.2.1.eAnlegen von Kryokonserven24
5.2.1.fAnlegen eines Virusstocks24
5.2.2Analysen25
5.2.2.aVitalitätsbestimmung mittels Trypanblaufärbung25
5.2.2.bVitalzellzahlbestimmung mittels MTT-Färbung26
5.2.2.cViren28
5.2.2.dGlucose28
5.2.3Verkapselung29
5.2.3.aKaspelerzeuger der Firma Steinau Verfahrenstechnik Berlin29
5.2.3.bInotech30
5.3Fermentation im 11 Bioreaktor31
6.Ergebnisse32
6.1Kultivi...
Diese Arbeit wurde unter der Zielsetzung angefertigt, die Methodik der Immobilisierung für das System SF21/ACMNPV zu optimieren und Maßstabsübertragungen bis hin zu technischen Fermentationen mit vergrößerten Arbeitsvolumina zu realisieren.
Ein Teil der Arbeit befasste sich mit dem Bereich der Optimierung des Kultivierungsmediums, wobei von einer Medienformulierung ausgegangen wurde, die in ihrer handelsüblichen Form schon ohne den Zusatzstoff Serum auskommt, und daher am ehesten zu einer Massenproduktion mit dem BEVS geeignet erscheint. Zu diesem Zweck wurden in der Literatur [1,8,15] gefundene Hinweise auf eventuell limitierende Medieninhaltsstoffe untersucht.
In vergleichenden Untersuchungen wurde versucht, die Zellen- bzw. Virenausbeuten in einen Zusammenhang mit überkonzentriert zugesetzten Medienkomponenten zu bringen.
Desweiteren wurden Hungerexperimente mit verkapselten Insektenzellkulturen vorgenommen, um Informationen über geeignete Fütterungsintervalle in Abhängigkeit der Zelldichte zu bekommen. Diesem Versuch lag die sogenannte Nutritional Depth" - Theorie [31 ], die für Suspensionskulturen aufgestellt wurde, zugrunde. Wie die Ergebnisse zeigen, kann dies für immobilisierte Kulturen nicht bestätigt werden.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine neuartige Technologie zur Immobilisierung von Zellen auf ihre Anwendbarkeit mit dem Natrium-Cellulosesulfat-Poly-DADMAC-System hin untersucht. Es handelte sich hierbei um ein Verkapselungsgerät der Firma Inotech, das im Gegensatz zu anderen vertropfenden Geräten auf dem dynamischen Prinzip resonanzinduzierter Zerlegung eines Strahls beruht, und somit höhere Durchflussraten und kürzere Verkapselungszeiten erwarten ließ.
Nach entsprechenden Modifikationen wurden mit diesem Gerät Kapselmengen erzeugt, die unter Anwendung der bisherigen Methode die 8-10fache Zeit in Anspruch genommen hätten. Die erzeugten Kapseln wurden in einem zu einem Standardrührkessel umfunktionierten Zellkulturfermenter mit 11 Arbeitsvolumen unter kontrollierter Rührerdrehzahl und konstantem Sauerstoffpartialdruck kultiviert.
Bei dieser weit über 1000 h dauernden Fermentation konnte das schon zuvor beobachtete Phänomen erkannt werden, dass immobilisierte Insektenzellen des Stammes SF 21 durch die Infektion mit Baculovirus AcMNPV nicht absterben, sondern noch mehrere hundert Stunden nach der Infektion Aktivität zeigen.
Inhaltsverzeichnis:Inhaltsverzeichnis:
InhaltsverzeichnisI
AbkürzungenII
1.Kurzfassung1
2.Einleitung2
3.Stand des Wissens5
3.1Produktion von Baculoviren als Biopestizide5
3.2Erhöhung der Effizienz der Viren6
3.3Erhöhung der Ausbeute7
3.3.1Medien7
3.3.2Kultivierungsmethoden8
3.4Immobilisierung10
3.4.1Immobilisierung in Cellulosesulfat10
3.4.2Immobilisierung Inotech11
3.5MTT12
3.6TEM13
4.Problemstellung15
5.Material und Methoden17
5.1Material17
5.1.1Zellinie und Virus17
5.1.2Geräte17
5.1.3Reagenzien18
5.2Methoden22
5.2.1Kultivierung der Zellen22
5.2.1.aAuftauen22
5.2.1.bKultivieren23
5.2.1.cKultivierung im Schüttelkolben23
5.2.1.dKapselkulturen24
5.2.1.eAnlegen von Kryokonserven24
5.2.1.fAnlegen eines Virusstocks24
5.2.2Analysen25
5.2.2.aVitalitätsbestimmung mittels Trypanblaufärbung25
5.2.2.bVitalzellzahlbestimmung mittels MTT-Färbung26
5.2.2.cViren28
5.2.2.dGlucose28
5.2.3Verkapselung29
5.2.3.aKaspelerzeuger der Firma Steinau Verfahrenstechnik Berlin29
5.2.3.bInotech30
5.3Fermentation im 11 Bioreaktor31
6.Ergebnisse32
6.1Kultivi...
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