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En el presente trabajo se describió y desarrolló el proceso de validación de la valoración microbiológica de antibióticos en cilindro-placa (difusión en agar), para la determinación cuantitativa de Bacitracina Zinc al 15% y Bacitracina Metilen Disalicilato al 11%, que incluye los requisitos exigidos en la determinación de parámetros analíticos de linealidad del sistema, linealidad del método, especificidad, exactitud, selectividad, límite de detección, límite de cuantificación y la precisión expresada en sus dos formas: repetibilidad y reproducibilidad.