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A associação de ruptura prematura de membranas (RPM) e infecção neonatal precoce tem sido alvo de vários estudos, pois os microrganismos responsáveis pela infecção neonatal relacionada com RPM são aqueles encontrados na flora vaginal normal e patogênica das gestantes. Para avaliar a associação da RPM com a presença do DNA genômico de diferentes bactérias em recém-nascidos foi realizado um estudo observacional, transversal, com recém-nascidos (RNs) provenientes de mães com diagnóstico de RPM. Foram coletadas amostras de sangue de 101 RNs e analisadas pela técnica de PCR convencional e PCR em tempo real para detecção do DNA genômico bacteriano e DNA genômico das bactérias Streptococcus agalactiae, Escherichia coli, Listeria monocytogenes e Klebsiella pneumoniae, respectivamente. Os RNs selecionados para o estudo estavam em antibioticoterapia e apresentaram um ou mais sinais clínicos característicos de infecção neonatal. Houve uma associação de sepse e ruptura prematura de membranase a presença de DNA genômico de diferentes bactérias. A utilização de primers específicos na PCR em tempo real torna o diagnóstico etiológico de sepse mais fidedigno comparado com a hemocultura.